病菌感染是导致机体致病死亡的重要因素,已被世界卫生组织确认为威胁人类健康的第二大隐患^[1]。某些病菌能够在人与人之间快速传播并引发疫情或流行病,对社会经济造成影响。常规的防护用纺织品如口罩和防护服等在病菌阻断领域发挥了不可替代的作用,然而这类产品主要通过物理吸附或过滤来抵御病原体,不具备主动消杀病原体的功能,当被大量丢弃时难以降解,给生态环境带来了沉重的负担。水刺非织造布具备手感柔软、透气透湿和生产高效的特点,成品外观接近传统纺织品,应用潜力巨大^[2],因此,开发高效、广谱、低毒、环保和经济的新型非织造材料是当前研究的首要目标。

纺织品的病菌阻断机制主要体现在3个方面:接触杀灭、释放抗菌物质和抗微生物黏附表面。接触杀灭主要包括强正电荷表面吸附病菌致使灭活、光触媒表面产生活性氧破坏病菌结构和光热表面产生局部高温杀灭病菌等^[3⇓-5]。释放抗菌物质是通过向微环境下释放能够抑制病菌生长的抑菌剂来达到灭菌的目的,主要包括金属粒子、酚类物质和抗生素等^[6⇓-8]。抗微生物黏附表面不同于以上2种形式,是一种被动防御的方法,通过物理或化学技术改造材料表面,使蛋白质等活性分子与抗黏附表面相互排斥^[9-10]。抗菌整理工艺与水刺产品特点适配尤为重要,水刺用品不适合采用昂贵的抑菌多肽或潜在毒性大的金属粒子进行抗菌整理,这些工艺不利于其大规模推广和安全应用,因而开发一种新颖的水刺棉抗菌整理方案势在必行^[11]。光动力微生物灭活已逐步用于纺织品的抗菌整理,该方法能够在有氧环境中产生强氧化性的活性氧杀死病原体,以探索非特异性方式灭活纺织品表面的病原体。Li等^[12]将聚集诱导发光光敏剂ASCP-TPA浸涂在非织造布表面,在10 min内杀灭99.999%的冠状病毒,显现出强效的自消毒能力和实时保护功能。

本文选择具备大量活性位点、表面易于改性、来源应用广泛的水刺棉作为非织造基布。首先,将低分子质量壳聚糖进行亲核加成制备壳聚糖胍盐,以提高其水溶性和吸附性;其次,利用柠檬酸在次磷酸钠的催化作用下共价交联羟基,实现壳聚糖胍盐对水刺棉的阳离子化改性;随后,依靠静电相互作用经染整一体化工艺负载叶绿素铜钠盐或孟加拉玫瑰红,得到的光动力水刺棉具有优异的抗菌性和安全性。光动力水刺棉通过生物基原料和无盐染色的方式制备,生产流程绿色环保、连续简便且易于实现,具有新一代光敏抑菌水刺用品的规模化应用潜力。

水刺棉(NCF,50 g/m²),福建省福能南纺卫生材料有限公司;壳聚糖(CS, 平均分子质量为30 000)、二氰二氨(DCD)、三氟甲磺酸钪、叶绿素铜钠盐、孟加拉玫瑰红、1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、甲基紫(MV)、噻唑蓝(MTT)、酵母浸膏粉,上海麦克林生化科技有限公司;盐酸、丙酮、无水乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸盐缓冲液、柠檬酸(CA)、次磷酸钠、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、琼脂粉,国药集团化学试剂有限公司;新鲜兔血,青岛安提赛生物科技有限公司;金黄色葡萄球菌(ATCC-6538)、大肠杆菌(ATCC-8099),上海协久生物科技有限公司;小鼠成纤维细胞(L929),上海赛柏慷生物技术股份有限公司。所有化学物质均为分析级试剂,使用时无需进一步纯化。

P-B0型小轧车,无锡铭翔机械设备有限公司;Ahiba IR型红外线染色机、Datacolor650型台式分光测色仪,美国Datacolor公司;Nicolet iS10型傅里叶红外光谱仪,美国赛默飞世尔科技有限公司;FLS1000型荧光光谱仪,英国爱丁堡公司;UV-2600型紫外/可见光分光光度计,日本岛津公司;SPARK-10M型酶标仪,瑞士TECAN公司;HD026N型多功能电子织物强力仪,南通宏大实验仪器有限公司;YG461E-II型全自动透气量仪、YG601H-II型电脑式织物透湿仪,宁波纺织仪器厂;YG(B)912E型纺织品防紫外性能测试仪,温州大荣纺织仪器有限公司。

通过亲核加成反应^[13]制备壳聚糖胍盐:称取2 g壳聚糖置于100 mL圆底烧瓶中,加入50 mL 1%盐酸水溶液搅拌过夜,直至壳聚糖完全溶解。按照物质的量比为1∶3,称取0.835 g二氰二氨和1.492 g三氟甲磺酸钪,加入上述壳聚糖溶液,将反应体系升温至100 ℃,冷凝回流反应6 h。反应结束后过滤除去不溶物,将滤液加入预冷的丙酮溶液中,可观察到大量白色絮状沉淀析出。将沉淀进一步用乙醇和丙酮洗涤2~3次,置于去离子水复溶并透析3 d,以去除未反应的二氰二氨,冷冻干燥后获得纯化的壳聚糖胍盐(GCS)。

GCS的共价交联:将水刺棉置于1%(质量分数)壳聚糖胍盐、3%(质量分数)柠檬酸和3%(质量分数)次磷酸钠的混合溶液中二浸二轧,轧余率为100%。将轧干的水刺棉在80 ℃下预烘180 s,在160 ℃下焙烘100 s,经多羧酸结构对羟基的共价交联作用,获得壳聚糖胍盐改性的水刺棉(GCF)。

光敏剂的无盐染色:利用红外线染色机实现对光敏剂的负载,光敏剂为叶绿素铜钠盐(CHL)或孟加拉玫瑰红(RB),用量为2%(o.w.f),浴比为1∶50。向染浴中加入GCF,以2 ℃/min的升温速率从室温升至90 ℃,保持90 ℃恒温染色30 min,再以3 ℃/min的降温速率冷却至40 ℃。染色结束后,经皂洗、水洗和干燥得到负载光敏剂的光动力水刺棉CHL-GCF或RB-GCF。

采用傅里叶红外光谱仪利用KBr压片法表征壳聚糖胍盐的化学官能团,扫描范围为3 500~500 cm^-1,分辨率为4 cm^-1,扫描16次。

采用傅里叶红外光谱仪利用ATR全反射法表征光动力水刺棉的化学官能团,扫描范围为3 500~500 cm^-1,分辨率为4 cm^-1,扫描32次;采用荧光光谱仪确定光敏剂的负载情况,激发光源为氙灯,探测范围为400~800 nm。

光动力水刺棉的外观色彩通过分光测色仪进行测试,光源类型为D65,观察视角为10°,测量口径为8 mm。每次测试前将样品对折4次,以防止水刺棉过薄导致透显现象,记录每个样品的色彩特征值(L^*、a^*和b^*值)和表观色深值(K/S值)。

光动力水刺棉的光动力学性能通过单线态氧和羟基自由基的产率表征^[14]。其中,单线态氧产率根据DPBF的氧化漂白来测试,将光动力水刺棉圆片(直径为16 mm)置于5 mL DPBF(80 μmol/L)的乙醇溶液中,用手持激光笔(532 nm, (85±1) mW/cm²)照射上述溶液特定时间,通过DPBF的紫外曲线变化以间接测定光动力水刺棉的单线态氧产率。对于羟基自由基的检测,更换探针底物为甲基紫(10 μmol/L),其它步骤与上述单线态氧的探测相似,施加光照条件。

细菌活化:取0.1 mL菌液(金黄色葡萄球菌或大肠杆菌)和7 mL细菌培养液置于摇菌管混合,并在37 ℃的恒温气浴振荡箱以100 r/min培养过夜,直至细菌生长到适宜浓度(1×10⁸~3×10⁸ CFU/mL),培养结束后,将菌液转移至离心机中以10 000 r/min离心10 min。然后倾倒上清液并加入等量的磷酸盐缓冲液,涡旋数秒使细菌重新悬浮且均匀分散。

抗菌实验:将上述悬浮的菌液稀释至1×10⁶~3×10⁶ CFU/mL作为实验浓度,灭菌后的光动力水刺棉圆片(直径为16 mm)分别置于24孔板中,每个样品进行3组平行实验。随后向每孔注入0.1 mL上述实验菌液,立即将孔板置于氙灯环境(60 000 lux,波长λ≥ 420 nm)曝光不同时间,其中C15和R15分别表示CHL-GCF和RB-GCF曝光15 min,其它组别依此类推。曝光结束后向每孔加入0.9 mL 磷酸盐缓冲液,手动搅拌30 s使细菌重新分散悬浮,按照1∶10体积比等梯度稀释4次,取50 μL菌液滴在培养基平板上。待滴完每个分区后轻轻晃动平板,置于37 ℃的恒温培养箱中孵育24 h,经平板计数法统计菌落数并计算存活率S和抑菌率A,计算公式如下:

式中:N为原菌液(对照组)可计数菌落的平均值;N_i为各样品组与对照组对应梯度下的菌落平均值。

通过模拟3种使役失效过程(室外光漂白、室内光漂白和家庭洗涤),对光动力水刺棉的抗菌耐久性进行评估。在模拟光漂白失效过程中,氙灯和办公室光源的光强分别为60 000 lux和800 lux, 以分别模拟室外光和室内光强度;洗涤失效过程参照GB/T 3921—2008《纺织品 色牢度试验 耐皂洗色牢度》的实验方法实施,洗涤时间为30 min,水温为40 ℃。在各组样品模拟失效过程结束后,按照1.3.4节方法进行抗菌性能测试。其中:XL-12代表氙灯曝光照射12 h;SW-7代表标准水洗7次;OL-14代表日光灯曝光照射14 d。

参考GB/T 3923.1—2013《纺织品 织物拉伸性能 第1部分:断裂强力和断裂伸长率的测定(条样法)》,随机剪取规格为30 cm×5 cm的水刺棉样品,隔距长度设定为20 cm,拉伸速度设定为10 cm/min,采用多功能电子织物强力仪测试各组样品的应力-应变曲线。参考GB/T 5453—1997《纺织品 织物透气性的测定》,测试面积设定为20 cm²,压降设定为100 Pa,采用全自动透气量仪随机选取不同的位点测试10次透气率,并计算平均值。参考GB/T 12704.1—2009《纺织品 织物透湿性试验方法 第1部分 吸湿法 》,温度和湿度分别设定为38 ℃和90%,水刺棉样品的测试面朝上置于透湿杯,采用电脑式织物透湿仪测试其透湿率。参考GB/T 18830—2009《纺织品 防紫外线性能的评定》,随机剪取4块边长为10 cm的正方形水刺棉样品,调湿平衡后在积分球入口处夹持样品,采用纺织品防紫外性能测试仪测试290~400 nm的紫外线透射比,并读取紫外线防护系数(UPF)。

血液安全性:取4 mL抗凝全血加入离心管并以2 000 r/min离心15 min,反复洗涤红细胞,直至上清液无色。然后采用磷酸盐缓冲液稀释至5%(体积分数)以形成红细胞悬浮液,将5 mg水刺棉样品置于离心管中,加入1 mL上述红细胞悬浮液中,并在37 ℃下孵育1 h。待孵育结束,将上述离心管以2 000 r/min离心15 min,采用酶标仪测定上清液在540 nm处的光密度,计算每组样品的溶血率^[15]。

细胞毒性:光动力水刺棉的细胞毒性采用MTT比色法评估。将L929细胞接种到96孔板中培养直至细胞贴壁生长,按照6 cm²/mL的浸提浓度将灭菌样品置于浸提介质中浸提。随后,将各样品的浸提液与上述L929细胞共同培养24 h,向每个孔加入100 μL的MTT溶液(0.5 g/L)并继续孵育4 h。孵育结束后,移除孔内液体后向每孔加入100 μL DMSO,以100 r/min振荡15 min以溶解生成的甲瓒,使用酶标仪检测各孔570 nm处的光密度值,计算每组样品的细胞相对活性^[15]。

为提高壳聚糖水溶性和对光敏剂的负载效率,利用DCD对壳聚糖氨基的亲核加成反应制备壳聚糖胍盐,合成路线如图1(a)所示。图1(b)示出壳聚糖和壳聚糖胍盐的红外光谱。可见,壳聚糖在1 648 cm^-1处(酰胺I带C=O的伸缩振动)和1 590 cm^-1处(酰胺II带N—H的弯曲振动)具有特征峰^[16]。经DCD亲核加成形成壳聚糖胍盐,在1 627 cm^-1和1 524 cm^-1处产生新特征峰,分别对应于—C=N的伸缩振动和C=NH²⁺的弯曲振动,以上结果表明壳聚糖的氨基转化为胍基^[17-18]。此外,壳聚糖的水溶解度仅为0.164 g/L,几乎完全不溶,而壳聚糖胍盐的水溶解度达到42.68 g/L。这是因为壳聚糖在改性过程中打破了分子内部的强氢键作用,引入亲水性的阳离子型侧链,从而具有较好的水溶性。

通过紫外光谱测试叶绿素铜钠盐和孟加拉玫瑰红的标准曲线,以进一步确定二者的负载率。拟合的标准曲线如图2所示。其中:叶绿素铜钠盐的拟合曲线为A_CHL=0.035 7C_CHL-0.021 6,R²=99.999%;孟加拉玫瑰红的拟合曲线为A_RB=0.093 9C_RB-0.020 1,R²=99.993%。式中:A表示吸光度;C表示浓度,μmol/L。

此外,通过测试光敏剂上染前后的染液和洗涤余液的吸光度,进一步确定CHL和RB在GCF表面的上染率和负载量。CHL-GCF和RB-GCF的上染率分别达到95.78%和96.46%,阴离子型光敏剂和阳离子化水刺棉依靠静电相互作用在无盐染色下实现了较好的上染效果。经水洗后的CHL-GCF和RB-GCF的负载量分别为18.57 mg/g和17.24 mg/g。与CHL相比,RB每个单元仅有1个羧酸盐基团,染色位点相对较少,可能导致RB与GCF的静电吸附稳定性较差,从而在后续的洗涤过程部分脱落,致使RB-GCF的负载量相对较低。

光动力水刺棉的外观特征由色彩空间和色彩深度表征。图3(a)示出色彩空间参数。可以看出,与NCF相比,GCF的彩度(a^*、b^*)略微黄移,明度(L^*)略微下降,不影响后续光敏剂的上染和负载。CHL-GCF的亮度明显降低,彩度向绿色和黄色偏移,呈现浅绿色外观;RB-GCF的亮度下降更加明显,彩度向红色和蓝色偏移,呈现浅红色外观。图3(b)示出表观色深曲线,2种光动力水刺棉的表观色深曲线与对应光敏剂的紫外可见吸收光谱相匹配,CHL-GCF和RB-GCF的表观色深(K/S值)分别达到3.55和4.72。以上结果表明,壳聚糖胍盐改性的阳离子表面利于光敏剂的负载。

通过红外光谱和荧光光谱验证光动力水刺棉的有机官能团特征和荧光发射行为。图4(a)示出光动力水刺棉的傅里叶变换红外光谱。可以看出,与NCF相比,GCF、CHL-GCF和RB-GCF均在1 724 cm^-1处出现明显的特征峰,归因于酯基C=O的伸缩振动,这表明多羧酸结构对羟基的成功交联^[19]。此外,光敏剂CHL和RB的负载并不影响改性水刺棉的主体结构。图4(b)示出光动力水刺棉的荧光光谱。受激后的光敏剂在从激发态返回基态的过程中会发出荧光,与GCF相比,CHL-GCF和RB-GCF在670 nm和600 nm附近显示出明显的荧光发射特性,与CHL和RB溶液的荧光光谱相匹配,因此,光动力水刺棉的结合机制可能是壳聚糖季铵盐和棉纤维的羟基通过CA的聚羧酸结构以酯化方式共价结合,蚕沙色素通过静电作用附着在阳离子棉纤维表面的季铵基团上。

光动力学性能揭示了光动力水刺棉的潜在机制和效用。图5(a)和(b)分别示出CHL-GCF和RB-GCF对DPBF随时间变化的吸光度曲线。

从图5(a)、(b)可以看出,CHL-GCF和RB-GCF对DPBF均具有显著的淬灭效果,在10 min内均能达到50%以上,间接表明二者均具备较高的单线态氧产率。

图5(c)示出RB-GCF对MV随时间变化的紫外吸收曲线,可见MV在1 h内淬灭仅22%,间接表明RB-GCF对羟基自由基的产率较低。然而,CHL-GCF对MV没有淬灭效果,表明CHL-GCF不能产生羟基自由基。不同材料和条件下的DPBF底物氧化曲线如图5(d)所示。可以看出,在光照下CHL-GCF、RB-GCF和GCF分别氧化80.15%、55.81%和25.52%的DPBF,而在暗室中CHL-GCF和RB-GCF几乎没有氧化DPBF。以上结果表明,光子和光敏剂(CHL和RB)是高效介导水刺棉光动力行为的必要条件,因此,CHL-GCF通过主导能量转移的光动力II型机制而产生单线态氧,RB-GCF可能同时发挥能量转移的光动力II型机制和电子转移的光动力I型机制产生单线态氧和羟基自由基,从而实现光动力抗菌灭活行为^[11]。

光动力水刺棉通过不同菌种和接触时间来表明抑菌活性的高效性和普适性。图6(a)和(b)分别示出光动力水刺棉对金黄色葡萄球和大肠杆菌的抑制效率。结果表明,GCF本身仅依靠阳离子表面对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用较差。CHL-GCF和RB-GCF在曝光15 min时均可对金黄色葡萄球菌达到99%以上的抑制效果,其中RB-GCF的抑制效率可达99.99%(达到检测限)。然而,CHL-GCF对大肠杆菌的杀灭效果较差,在60 min内达到92.36%的抑菌率;RB-GCF对大肠杆菌的抗性相对较好,在60 min内达到99.63%的抑菌率。总之,2种光动力水刺棉对革兰氏阳性菌具备短时高效的杀灭效果,但对革兰氏阴性菌的抑制效果不太理想,因为革兰氏阴性菌的胞壁结构更为复杂,阴离子型光敏剂与电负性更强的革兰氏阴性菌之间的静电排斥力更强,导致光毒性物质的作用位点减少^[20]。

光动力水刺棉的主要抗菌机制为:在光子的激发下,负载于水刺棉表面的光敏剂CHL和RB从基态跃迁至单重激发态,经系间窜越到三重激发态,依靠能量转移或电子转移,生成强氧化性的单线态氧或羟基自由基,从而高效氧化细菌的脂质、蛋白质和核酸等生物大分子,对细菌胞壁和内部组分造成不可逆的损伤,从而诱导细菌的凋亡^[12,14,20]。

光动力水刺棉的抗菌耐久性仍需进一步评估,尤其是光稳定性,是水刺棉应用的关键指标。模拟3种使役环境下光动力水刺棉对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率,结果如图6(c)和(d)所示。结果表明,在模拟室外光漂白条件下,氙灯老化12 h的CHL-GCF对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别下降至82.21%和52.73%,而同样条件下RB-GCF对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别下降至94.69%和88.55%,表明RB-GCF对强光的耐漂白性相对较好,而CHL-GCF在强光下发生光漂白而破坏CHL分子的现象更加明显。值得注意的是,光动力水刺棉对室内光漂白具备较优的稳定性,抑菌效率显著。此外,经过7个标准水洗循环后,CHL-GCF对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别下降至99.58%和75.53%,RB-GCF对应的抑菌率分别下降至91.34%和80.36%,相比之下RB-GCF对水洗的耐受性较差,与前述制备过程中的皂洗掉色相对明显致使负载量较低的结果一致。

表1示出光动力水刺棉的断裂强力、透湿率、透气率和紫外线防护系数。相比于NCF而言,GCF、CHL-GCF和RB-GCF的断裂强力保持率约为70%,归因于CA化学交联和高固化温度限制了水刺棉中纤维素大分子链之间的相对滑动。光动力水刺棉CHL-GCF和RB-GCF的透气率和透湿率平均值分别降至1 442.92 mm/s和2 475.8 g/(m²·d),降幅均为15%左右,归因于壳聚糖胍盐的成膜性在一定程度上阻塞了水刺棉的部分孔隙,致使透气透湿性略微下降。此外,CHL-GCF和RB-GCF的紫外线防护系数分别达到32.26±1.15和19.78±0.48,具备一定的紫外线屏蔽能力。

作为一种皮肤直接接触的纺织品,光动力水刺棉的生物安全性需要进行评估。图7示出光动力水刺棉的溶血率和细胞相对活性。结果表明,对于血液安全性而言,CHL-GCF和RB-GCF的1 h溶血率分别为1.56%和3.67%,低于ISO 10993-4:2017《医疗器械生物学评价 第4部分:与血液相互作用试验选择》规定的5%,表明光动力水刺棉对血细胞无负面影响。对于细胞相容性而言,NCF显示细胞增殖正常,CHL-GCF和RB-GCF具有轻微的细胞毒性,经GCF、CHL-GCF和RB-GCF的提取物共培养24 h后,L929细胞的相对活性分别为93.78%、86.28%和78.75%,符合ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验》的要求,表明光动力水刺棉对细胞的潜在毒性较小。RB-GCF的生物安全性相对较低,原因可能是RB-GCF与溶液体系接触易溢出脱离或RB光敏氧化效果较强。然而,CHL-GCF和RB-GCF的血液安全性和细胞安全性均在合理范围内,满足生物医用材料的相关要求,这是考虑将这类光动力纺织品转化为实际应用的必要一步。

本文以水刺棉为基材,经壳聚糖胍盐共价交联改性,再通过无盐染色方法负载光敏剂叶绿素铜钠盐或孟加拉玫瑰红,开发了一种具备光致微生物灭活效果的抗菌水刺棉,得到如下结论。

1) 通过红外光谱和荧光光谱验证了水刺棉的阳离子化和光敏剂的成功负载,壳聚糖胍盐和棉纤维的羟基经柠檬酸以酯基的形式共价结合,阴离子型光敏剂依靠静电作用吸附在阳离子化棉表面,从外观上分别呈现浅绿色和浅红色。

2) 在模拟日光条件下,光动力水刺棉在15 min内杀灭99%以上的金黄色葡萄球菌,在60 min内杀灭90%以上的大肠杆菌,以上优势归因于光敏剂在光照下可产生强氧化性的活性氧杀灭微生物,表现出优良的高效灭活性能和使役耐久性。

3) 光动力水刺棉的物理性能和生物安全性指标均满足相关标准要求,表现出良好的接触舒适性和低毒性。